刺客信条3场景主要发生在纽约和波士顿，主角是一位叫康纳（Connor）的英美混血儿，父亲是英国人，母亲是美国原住民。在《刺客信条3》的开局阶段，玩家将首先体验康纳的父亲，到了第四章就会体验康纳的生活，当时他由莫霍克族（原住纽约州的印第安人）抚养长大。在英国殖民者进攻并烧毁了康纳的村庄后，他较终走上一条对抗暴政（和圣殿骑士）的道路。本作的故事仍然以刺客组织与圣殿骑士的斗争为主线。